File:Diagrama de Microscopia eletrônica criogênica.svg

Português: O fluxo de trabalho para um experimento típico de criomicroscopia eletrônica (cryo-EM) pode ser dividido em várias etapas, incluindo preparação da amostra, preparação da grade, coleta de dados, processamento de imagens e determinação da estrutura. Aqui está uma breve visão geral de cada etapa:

1. Preparação da amostra: Isso envolve a purificação da amostra biológica de interesse, como uma proteína, complexo de proteínas, vírus ou célula. A amostra deve estar em um estado purificado e homogêneo, livre de contaminantes e agregados. Dependendo da amostra, várias técnicas, como cromatografia de exclusão por tamanho, cromatografia de afinidade ou ultracentrifugação, podem ser usadas para purificação.

2. Preparação da grade: A amostra purificada é então aplicada em uma grade especial de microscopia eletrônica, geralmente feita de carbono ou ouro. A grade é tratada primeiro com uma fina camada de um polímero hidrofílico para evitar que a amostra grude na grade. A amostra é então aplicada na grade e o excesso de solução é removido por blotting. A grade é então rapidamente congelada em etano líquido ou propano para criar uma fina camada de gelo vítreo ao redor da amostra.

3. Coleta de dados: As grades congeladas são carregadas em um microscópio eletrônico criogênico, e as imagens são coletadas usando um feixe de elétrons. O microscópio pode ser operado no modo automático ou manual. No modo automático, o software do microscópio seleciona automaticamente as grades e adquire imagens de diferentes áreas na grade. No modo manual, o usuário seleciona manualmente regiões de interesse na grade para aquisição de imagens. Tipicamente, centenas a milhares de imagens são coletadas a partir de diferentes ângulos, que serão usadas para processamento posterior.

4. Processamento de imagens: As imagens coletadas são processadas para melhorar sua qualidade e gerar uma reconstrução 3D da amostra. Isso envolve várias etapas, incluindo identificação de partículas, classificação 2D, média e refinamento. Na identificação de partículas, as partículas individuais nas imagens são identificadas e extraídas. Na classificação 2D, as partículas são classificadas em diferentes classes com base em suas orientações e similaridades.

5. Na reconstrução 3D, as partículas classificadas são usadas para gerar um mapa de densidade 3D da amostra.

6. Modelagem e refinamento: Uma vez obtido o mapa 3D, um modelo estrutural da proteína ou complexo pode ser construído usando métodos computacionais. O modelo é refinado iterativamente, comparando-o com o mapa de cryo-EM e fazendo ajustes até obter um modelo de alta qualidade.

7. Análise do modelo estrutural: O modelo estrutural pode ser analisado para obter insights sobre a estrutura e função da proteína ou complexo, como compreender como ela interage com outras moléculas